ELISA试剂盒间接法的操作步骤

    ELISA试剂盒间接法的操作步骤

    ELISA试剂盒间接法‌的操作步骤主要包括抗原包被、封闭、加样孵育、酶标二抗结合、显色与检测等关键环节，用于高灵敏度地检测样本中特异性抗体的存在。

    试剂准备‌

    从冰箱取出试剂盒，平衡至室温（18–25℃），确保所有试剂温度一致。按说明书将酶标二抗、底物等稀释至工作浓度。

    包被抗原‌

    用包被缓冲液将已知抗原稀释至合适浓度（如1–10μg/ml），每孔加入100μl至酶标板，4℃过夜孵育，使抗原牢固吸附于固相表面。

    封闭‌

    倒掉孔内液体，拍干后每孔加入封闭液（如5%BSA或10%脱脂奶粉），37℃孵育1小时，阻断非特异性结合位点，减少背景干扰。

    加样孵育‌

    洗涤3–5次后，加入适当稀释的待测样本（如血清，通常1:100–1:200稀释），每孔100μl，设空白、阴性及阳性对照孔，37℃孵育1–2小时，使抗体与抗原特异性结合。

    加酶标二抗‌

    洗涤后加入稀释好的酶标二抗（如HRP标记的抗物种IgG抗体），每孔100μl，37℃孵育30–60分钟，使其与已结合的一抗Fc段结合，实现信号放大。

    显色反应‌

    洗涤5–6次后，加入新鲜配制的底物溶液（如TMB），每孔100μl，室温避光孵育15–30分钟，观察颜色变化。

    终止反应‌

    每孔加入50–100μl终止液（如2MH₂SO₄），终止酶促反应，颜色由蓝变黄。

    读数分析‌

    使用酶标仪在450nm波长下读取各孔吸光度（OD值），根据阳性/阴性对照判断结果，或通过标准曲线定量抗体浓度。

    注：以上供参考！

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