如何预防ELISA实验样本处理错误?

　　如何预防ELISA实验样本处理错误?

　　一、样本采集与保存规范

　　抗凝剂选择与处理‌

　　使用EDTA抗凝血浆时需立即颠倒混匀5-8次，避免局部凝血‌。

　　避免使用肝素钠(可能干扰抗原-抗体结合)或含叠氮钠的保存液(抑制HRP酶活性)‌。

　　保存条件优化‌

　　短期检测(≤7天)样本可4℃保存，长期需分装后-80℃冻存，避免反复冻融(>3次)导致蛋白降解‌。

　　组织样本需加入蛋白酶抑制剂(如PMSF)后匀浆，分装保存‌。

　　二、样本预处理关键步骤

　　离心参数标准化‌

　　血清/血浆需3000×g离心20分钟，4℃操作，确保去除细胞碎片‌。

　　尿液/脑脊液需高速离心(10000×g)或0.22 μm滤膜过滤去除颗粒物‌。

　　稀释与干扰控制‌

　　高浓度样本需预实验确定稀释倍数(如1:5至1:20)，避免“钩状效应"‌。

　　溶血样本需超滤处理或稀释，避免血红蛋白干扰显色‌。

　　三、操作流程防错措施

　　加样与污染预防‌

　　使用带滤芯枪头，每孔更换吸头，避免交叉污染‌。

　　冷藏样本需室温平衡30分钟后再加样，确保反应均一性‌。

　　洗涤与封闭规范‌

　　洗涤液需注满孔内(避免残留)，重复5-6次，每次静置30秒‌。

　　封闭液推荐5% BSA或脱脂牛奶，孵育≥30分钟以减少非特异性结合‌。

　　四、质控与验证

　　对照设置‌

　　每批次实验需包含空白孔、阴性对照(健康样本)及阳性对照(标准品)‌。

　　回收率试验：向样本中添加已知浓度标准品，验证检测效率‌。

　　仪器校准‌

　　定期校准移液器(如5-10 μL小体积加样)和酶标仪波长(如TMB底物450nm)‌。

　　五、常见问题快速排查

　　显色淡/灵敏度低‌：检查抗体效价、样本是否反复冻融或酶标物失活‌。

　　高背景信号‌：确认封闭充分、底物避光保存且孵育时间≤15分钟‌。

　　注：以上仅供参考，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。

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