ELISA实验加样步骤详述

　　以下是天正信达ELISA实验加样步骤的详细流程及关键注意事项，结合多个来源的操作规范整理而成：

　　一、实验前准备‌

　　试剂平衡‌

　　将试剂盒(标准品、酶标板、检测抗体等)从冰箱取出，室温静置30分钟至平衡‌。

　　稀释标准品‌

　　准备7支离心管(标记S0-S6)，每管加入250μL标准品稀释液‌。

　　取原液标准品(S1)250μL加入S0管，混匀后依次等比稀释至S6管(S0为空白对照)‌。

　　酶标板处理‌

　　拆下所需板条，剩余板条密封保存于-20℃‌。

　　二、加样步骤‌

　　标准品与样本上样‌

　　标准品孔：每孔加入50μL不同浓度标准品，建议设置双复孔‌。

　　样本孔：加入待测样本50μL(如血清、细胞裂解液)，避免样本接触孔壁‌。

　　空白孔：仅加稀释液(如样本稀释液)50μL作为对照‌。

　　检测抗体添加‌

　　每孔加入100μL生物素化抗体工作液(临用前稀释)，覆膜后37℃孵育60分钟‌。

　　三、孵育与洗涤‌

　　孵育条件‌

　　37℃恒温箱孵育60分钟(二步法)或30分钟(一步法)‌。

　　避免孵育温度波动，建议使用恒温箱而非烘箱‌。

　　洗涤操作‌

　　弃去液体，每孔加满350μL洗涤液，静置1分钟后甩干，重复5次‌。

　　拍干时避免残留气泡，防止交叉污染‌。

　　四、显色与检测‌

　　显色反应‌

　　每孔加入TMB显色液50μL，避光37℃孵育15-30分钟(蓝色显色)‌。

　　显色时间需严格控制，避免过度反应导致背景升高‌。

　　终止与读数‌

　　加入50μL终止液(蓝色转黄色)，5分钟内用酶标仪450nm测OD值‌。

　　五、常见问题规避‌

　　加样误差‌：使用排枪或校准过的移液器，避免枪头重复使用‌。

　　边缘效应‌：覆膜需贴紧，孵育时避免边缘孔干燥‌。

　　数据异常‌：若复孔CV值>10%，需检查加样一致性或洗涤效果‌。

　　综上，说明书标曲在严格匹配实验条件时可作为参考，但实际应用中需结合样本特性进行验证或调整‌。

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